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电泳液最新娱乐体验_wb电泳液和转膜液配方(2024年11月深度解析)

内容来源：中小站长动力网所属栏目：话题更新日期：2024-11-28

电泳液

高考后别松懈！学点实验室技能恭喜大家终于结束了高考这场“战役”！是时候放松一下了，但别忘了继续充实自己哦！在大学和研究生阶段，实验室仪器是你们必须要掌握的技能。今天就来给大家盘点一下实验室里那些常见的仪器，以及它们各自的用途和注意事项。实验仪器大盘点 𐟔슧滥🃦œ𚯼š用于分离液体和固体，或者在液体中分离不同密度的物质。使用时要小心操作，避免液体溅出。分光光度计：用于测量溶液的吸光度，常用于化学分析和生物实验。操作时要保持仪器清洁，避免污染。 PCR仪：聚合酶链式反应的仪器，用于扩增DNA片段。使用时要注意温度控制和反应时间。电泳仪：用于分离和纯化DNA、RNA等生物大分子。操作时要确保电泳液的选择和浓度。显微镜：观察细胞和组织的结构，是生物学和医学实验的基础工具。使用时要注意光源的选择和镜头的清洁。如何高效使用实验室仪器？ 𐟒ኊ熟练掌握这些仪器的使用方法，可以有效提高实验的精度和效率。以下是一些建议：多实践：多动手操作，熟悉仪器的各个部件和操作流程。记录细节：每次使用后记录仪器的状态和使用情况，方便后续维护和管理。定期维护：定期检查仪器的性能和准确性，确保其正常运行。

史上最全WB实验操作及原理讲解③ Western Blot 实验通常使用SDS-PAGE进行电泳，根据目的蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。以10%的SDS-PAGE自制胶为例，以下是详细的操作步骤和注意事项：制备凝胶 𐟧ꊨㅩ…好灌胶的模具，按照配方配置分离胶（适量的丙烯酰胺溶液、10% SDS、分离胶缓冲液），加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（不要产生气泡）后缓慢加入到模具中。再在页面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40分钟。待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的水。同样按比例配置浓缩胶（浓缩胶浓度较分离胶低），缓慢加入分离胶的上面，直至灌满。将梳子插入凝胶内，注意不得在梳子齿尖留有气泡，静置60分钟以上待凝胶聚合后拔出梳子。注意事项及原理 𐟓‹ 分离胶浓度：不同的分离胶浓度对不同的目的蛋白分子量的分辨率不一样，所以Western Blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量。过硫酸铵和TEMED的量：聚丙烯酰胺(PAGE)是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，这个聚合反应是自由基聚合，需要有引发剂产生自由基将反应引发。过硫酸铵（AP）就是引发剂，而TEMED（四甲基乙二胺）可以催化过硫酸铵产生自由基，催化聚丙烯酰胺单体聚合成网状结构。但是两者的量一定适宜，否则会有烧胶或带变形的可能。加入一层水：在注入分离胶后上面需要加入一层水，这是因为空气中的氧分子会氧化AP使其活性减弱。加入这层水后可以让反应快速进行，同时也保证了分离胶上层面的平整。加样 𐟒犥𐏥🃦‹”出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并组装好。将电泳缓冲液加入内外槽，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲液中。将待测蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，沸水中加热3-5分钟使蛋白充分变性。将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。加样时间要尽量短，以免样品扩散。电泳 𐟔‹ 当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。电泳时通常上层浓缩胶时采用低电压（80-100V）恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层分离胶时采用高电压（120V）恒压电泳。溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端时停止电泳。电泳完毕的胶完整地放在盛有电泳液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来。持续更新，敬请关注~

MAPK通路蛋白：MEK1/2&ERK 𐟔 前情提示： 1️⃣ 所有实验结果均来自小鼠肝脏组织的蛋白样本（由于模型复杂且干预因素众多，具体细节不赘述）。 2️⃣ 电泳液、转膜液、TBST均采用粉末配置成10X，再稀释至1X（经济节约）。电泳时间未详细记录，转膜条件为300mA，70分钟。 3️⃣ 一抗孵育时间为14-16小时，洗膜步骤为1✖️TBST，5分钟*3；二抗孵育时间为1小时，洗膜步骤为1✖️TBST，10分钟*3。 𐟓Š 图一：MAPK通路，MEK1/2，稀释比1:1000，结果显示条带清晰，无杂带，目的条带表达强烈。 𐟓Š 图二：MAPK通路，ERK，稀释比1:1000，条带位置清晰，基本无杂带。 𐟓Š 图三：MAPK通路，p38，条带较为杂乱，可能原因包括一抗特异性不足或稀释比需要调整。pp38条带位置与预期有所不同，需要进一步优化实验条件。 𐟤 作为WB新手，欢迎各位高手交流实验经验！

marker条带图制作漂亮的DNA Marker条带图其实非常简单。只需将DNA Marker与电泳液按1:1的比例混合均匀，然后加入点样孔中。这样跑出来的条带效果如图所示，清晰、美观。𐟑Œ

𐟔„电转液配置与转膜技巧 𐟧ꩅ置电转液是跑出平整WB的关键一步！使用索莱宝的10㗧”𕨽즶𒱰0ml，加入甲醇200ml和up水700ml，混合成1L的1㗧”𕨽즶𒯼Œ4℃冷藏保存。 𐟔騽쨆œ时，根据目的蛋白分子量切胶，并裁剪适当大小的PVDF膜。使用甲醇激活膜后，进行半干转或湿转操作。 𐟒᥍Š干转时，按照滤纸片-膜-胶-滤纸片的顺序叠放，恒压12v转1小时。湿转则采用“三明治”系统，恒流200ma转90分钟。 𐟓Œ注意：电转系统需置于冰盒中以防止产热，且湿转的电泳液一般使用一两次后更换。 𐟔’封闭步骤也很关键，可选择脱脂奶粉或快速封闭液进行封闭，时间充裕时推荐使用脱脂奶粉封闭2小时。 𐟒‰最后，选择好的一抗进行孵育，一般1：1000的比例使用。将全膜放在抗体孵育盒中，4℃摇床缓慢孵育12～18小时。 𐟎‰掌握这些技巧，你的WB实验定能更加成功！

WB实验内参双条带？原因及解决方法详解嘿，做WB实验的小伙伴们，你们有没有遇到过内参双条带的情况？别急，这种情况其实挺常见的。先来分析一下可能的原因吧。内参蛋白降解 𐟧ꊩ斥…ˆ，内参蛋白降解是一个常见的原因。所以在裂解细胞的时候，一定要记得及时加入蛋白酶抑制剂，不然内参蛋白就会被降解了。多克隆抗体的问题 𐟐𐊥†…参抗体如果是多克隆的，那就要注意了。这种抗体本质上是一个抗体混合物，容易和其他蛋白的抗原位点结合，从而产生杂带。你可以试试在4度摇床上过夜孵育，或者稀释抗体的浓度来降低杂带的概率。有条件的话，还是选单克隆抗体吧，虽然价格贵点，但效果更好。凝胶和电泳液的问题 𐟓Š 凝胶和电泳液的pH值也很重要，它会影响蛋白的迁移和分离。所以一定要把控好pH值，确保实验条件最佳。胶片曝光时的操作 𐟓𘊧”訃𖧉‡曝光的小伙伴们注意了，操作时千万别让胶片位移，不然也会导致双条带哦。抗体剥离不完全 𐟧ꊥ悦žœ你在孵育内参前剥离过抗体，而且内参和目的蛋白的分子量接近，那没剥离完全就会显出之前的条带。所以剥离抗体时要小心，确保完全剥离。抗体污染 𐟧ꊩ‡复使用内参抗体会增加污染的几率，也会导致双条带。所以尽量不要重复使用抗体，确保实验的准确性。这些原因可能同时出现，所以做实验前一定要逐一检查排除，这样才能确保实验顺利进行。希望这些小贴士能帮到你们！𐟒ꀀ

内参有杂带在WB（Western Blot）实验中，许多研究人员可能会遇到内参条带异常的现象，这可能对实验结果造成困扰。𐟤” 内参蛋白通常不应该出现多个条带，但如果出现了，这可能是由多种原因引起的。下面我们来详细探讨这些可能的原因，并提供一些解决方案。 1️⃣ 内参蛋白降解：在裂解细胞时，如果没有及时加入蛋白酶抑制剂，内参蛋白可能会被降解，导致出现多个条带。𐟌€ 2️⃣ 多克隆抗体特性：内参抗体通常是多克隆抗体，由多种抗体组成。如果其他蛋白有与这些抗体结合的抗原位点，就会出现杂带。建议延长孵育时间至4度摇床过夜，并稀释内参抗体浓度，以减少杂带的出现。有条件的话，可以选择单克隆抗体，虽然价格较高，但特异性更强。𐟒‰ 3️⃣ 凝胶和电泳液的pH值：凝胶和电泳液的pH值会影响蛋白质的迁移速率和分离程度。确保这些条件在实验中保持一致，以获得清晰的条带。𐟓 4️⃣ 胶片曝光操作：如果你还在使用胶片曝光，操作时胶片的位移可能会导致两个条带的出现。𐟎劊5️⃣ 抗体剥离不完全：在孵育内参之前，如果剥离过抗体，特别是内参和目的蛋白分子量接近的情况，若没有剥离完全，会显影出之前的条带。𐟔„ 6️⃣ 抗体重复使用：虽然内参抗体效果好，很多实验室会选择重复使用，但这会增加抗体污染的几率，导致双条带产生。𐟔„ 这些原因可能同时存在，因此在实验之前需要逐一检查并排除可能性。通过仔细检查实验条件和操作步骤，可以减少内参双条带出现的概率，确保实验结果的准确性。𐟒ꀀ

改良WB，1.5小时搞定一抗 𐟓‹ 材料清单雅酶12%预制胶（15孔）雅酶电泳液（moda）雅酶三色预染marker（wj103）赛维尔免冰浴转膜液雅酶无滤纸海绵垫碧云天快速封闭液碧云天Western Blot洗涤液雅酶抗体通用稀释液雅酶显影液雅酶PVDF膜（0.45um） 𐟓ˆ 改良版步骤煮蛋白：将蛋白提前煮沸10分钟，同时配置约800ml的moda电泳液。准备电泳：安装预制胶并倒入电泳液，拔出梳子。加样：选择15孔胶，样品加在12个孔中，两边和中间都加上marker。为了方便区分，1号孔加5ul的雅酶预染marker，15号孔加1ul。跑胶：下层胶12%浓度，选用160V恒压，45分钟。如果使用自己配的胶，建议选用雅酶一步法配胶试剂盒，电泳液选择塞维尔快速高分辨电泳缓冲液，180V 30分钟即可。转膜准备：提前10-15分钟准备转膜所需物品，包括PVDF膜甲醇激活、免冰浴转膜液、无滤纸海绵垫浸泡。切割胶和形成三明治夹心：将胶切割并形成三明治夹心，注意黑胶白膜。转膜：400mA恒流，20分钟。如果跑的是小分子，70kd以下延长到30分钟，100kd及以上40分钟。转膜后胶上非常干净，基本完整的全部转到膜上。封闭和洗涤：快速封闭液孵育10-15分钟，洗涤液洗一次10分钟。期间可以把配好的一抗倒到盒子里，待敷完+洗完的膜准备完毕就可以快速裁剪入盒啦。总时长：总时长约1小时50分钟。 𐟓Š 结果展示图9展示了其中一张实验结果。可以看到，5ul的marker足够显影，和1ul对比也非常明显，适合懒人或迷糊的科研狗分辨顺序。

wb显影整张膜都是黑的在实验过程中，制胶是关键的一步。首先，确保玻璃片彻底清洗干净，并用纯水润洗后烘干。注意，不要用手直接接触灌胶的地方，因为手套上可能有灰尘和指纹。在配置下层胶时，要按比例混合，但记得要放置一段时间，让胶完全凝固。如果室温较低，可以增加APS的量。压胶时，使用纯水快速加入上层胶，然后插入梳子。梳子要提前准备好。电泳液和电转液要按比例现配现用。电泳液在放电泳槽外侧，内侧使用新的电泳液。转膜液也建议使用新的，最多使用两次后加入无水甲醇。不同分子量的蛋白需要不同的电转时间，记得分子量越大，转膜时间越长。转膜时，确保胶与PVDF膜之间没有气泡，这是蛋白印迹完整的关键。封闭可以选择威奥的封闭液或脱脂牛奶。最后，洗膜时要充分彻底，否则膜背景会发黑。如果发现黑点，可能是封闭液没有完全溶解或没有洗干净。保持耐心，认真完成每一步，就能轻松搞定WB实验！

WB实验注意事项：战胜西方印记的秘诀！ 𐟓Š 电泳注意事项制胶要均匀：胶越均匀，条带越窄，分离效果越好。压平下层胶：加入下层胶后，用无水乙醇或水压平，避免形成波浪状。上层胶要多配：防止漏液。梳子要垂直：拔出时要小心，可用针头拨正。电泳液回收：次数不宜太多，以免影响电流。电泳液浑浊：及时弃掉，否则影响电泳。上样速度：要快，尽快电泳，冰浴条件下进行。 𐟔„ 电转注意事项戴手套：全程使用手套和镊子，避免直接触碰膜。激活PVDF膜：提前泡在甲醇中激活，再放入转膜液中中和。标记PVDF膜：提前做好标记，方便区分。选择合适膜：大蛋白用0.45um，小蛋白用0.22um。裁膜：注意胶的大小，过大过小都会影响转膜。滤纸：薄滤纸两侧各用两张，厚滤纸两侧各垫一张。气泡：转膜时不能出现气泡，要及时排出。冰浴：转膜时释放大量热量，冰浴至关重要。 𐟔’ 封闭注意事项封闭液比例：注意配置比例，切勿配错。摇匀封闭液：摇匀封闭液，避免背景脏。封闭液使用次数：封闭液出现颗粒感时就不能用了。 𐟐𐠥�𘀦Š—二抗注意事项稀释比例：注意一二抗的稀释比例，仔细阅读说明书。选择一抗：根据样本选择一抗，根据一抗种属选择二抗。有效期：在有效期内使用一二抗。孵育条件：一抗建议4℃冰箱中摇床孵育过夜，防止背景高。通过这些注意事项，你可以更好地掌握WB实验的技巧，提高实验结果的准确性。

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