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"电泳缓冲液 "新上映_1x蛋白电泳缓冲液配方(2024年11月抢先看)

内容来源：中小站长动力网所属栏目：导读更新日期：2024-11-28

"电泳缓冲液 "

史上最全WB实验操作及原理讲解③ Western Blot 实验通常使用SDS-PAGE进行电泳，根据目的蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。以10%的SDS-PAGE自制胶为例，以下是详细的操作步骤和注意事项：制备凝胶 𐟧ꊨㅩ…好灌胶的模具，按照配方配置分离胶（适量的丙烯酰胺溶液、10% SDS、分离胶缓冲液），加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（不要产生气泡）后缓慢加入到模具中。再在页面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40分钟。待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的水。同样按比例配置浓缩胶（浓缩胶浓度较分离胶低），缓慢加入分离胶的上面，直至灌满。将梳子插入凝胶内，注意不得在梳子齿尖留有气泡，静置60分钟以上待凝胶聚合后拔出梳子。注意事项及原理 𐟓‹ 分离胶浓度：不同的分离胶浓度对不同的目的蛋白分子量的分辨率不一样，所以Western Blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量。过硫酸铵和TEMED的量：聚丙烯酰胺(PAGE)是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，这个聚合反应是自由基聚合，需要有引发剂产生自由基将反应引发。过硫酸铵（AP）就是引发剂，而TEMED（四甲基乙二胺）可以催化过硫酸铵产生自由基，催化聚丙烯酰胺单体聚合成网状结构。但是两者的量一定适宜，否则会有烧胶或带变形的可能。加入一层水：在注入分离胶后上面需要加入一层水，这是因为空气中的氧分子会氧化AP使其活性减弱。加入这层水后可以让反应快速进行，同时也保证了分离胶上层面的平整。加样 𐟒犥𐏥🃦‹”出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并组装好。将电泳缓冲液加入内外槽，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲液中。将待测蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，沸水中加热3-5分钟使蛋白充分变性。将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。加样时间要尽量短，以免样品扩散。电泳 𐟔‹ 当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。电泳时通常上层浓缩胶时采用低电压（80-100V）恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层分离胶时采用高电压（120V）恒压电泳。溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端时停止电泳。电泳完毕的胶完整地放在盛有电泳液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来。持续更新，敬请关注~

𐟚€ 加速WB实验的四大秘籍！𐟏 Western Blot（WB）是分子生物学中常用的实验技术，用于检测特定蛋白质的存在和量。由于步骤复杂，常规操作耗时较长。以下是四个秘籍，帮助你将整个实验过程缩短至80分钟内完成： 1️⃣ 优化电泳缓冲液： 𐟔堦高电泳效率：通过调整运行缓冲液配方，室温下200V的条件下，可在35分钟内完成电泳。 𐟔砩똧”𕥎‹适应性：即使电压提升至300V，改进后的缓冲液也能保持正常工作，不会造成蛋白质的丢失。 2️⃣ 简化凝胶制备步骤： 𐟔젨‡꧔𑥟𚥼•发反应：利用TEMED催化AP（过硫酸铵）生成自由基，引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺之间的交联反应，形成稳定的三维网络结构。 𐟧Š 凝胶保存：将前五种试剂混合后，可在4℃黑暗环境中保存一个月或更长时间，从而简化实验前的准备工作。 3️⃣ 选择合适的转移膜： 𐟔„ 对于小分子量蛋白质，0.22⵭的PVDF膜比0.45⵭的NC膜具有更强的拦截能力，从而提高了蛋白质的检测灵敏度和准确性。 4️⃣ 调整电转移时间： 𐟕’ 不同分子量的蛋白质适合不同的电转移时间： 10-25 kDa：250V，15分钟 25-55 kDa：250V，20分钟 55-70 kDa：250V，25分钟 70-130 kDa：250V，30-35分钟通过采纳上述四大秘籍，你的WB实验不仅可以在更短的时间内完成，还能保持高质量的实验结果，有效提升实验效率和输出。大家还有其他秘籍欢迎分享探讨！

b612号小行星 𐟓– 蛋白质电泳实验中，正确的试剂和缓冲液配置至关重要。以下是详细的方法和配方，助你顺利开展实验。 1️⃣ 30%（W/V）丙烯酰胺溶液称量290g丙烯酰胺和10g甲叉双丙烯酰胺，置于1L烧杯中。加入约600ml去离子水，搅拌至完全溶解。定容至1L，用0.45滤器过滤杂质。保存于棕色瓶中，4℃保存。注意：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时请戴手套。 2️⃣ 40%（W/V）丙烯酰胺溶液称量380g丙烯酰胺和20g甲叉双丙烯酰胺，置于1L烧杯中。加入约600ml去离子水，搅拌至完全溶解。定容至1L，用0.45滤器过滤杂质。保存于棕色瓶中，4℃保存。注意：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时请戴手套。 3️⃣ 5㗔ris-Glycine Buffer（SDS PAGE电泳缓冲液）称量15.1g Tris、94g Glycine和5.0g SDS，置于1L烧杯中。加入约800ml去离子水，搅拌至完全溶解。定容至1L，室温保存。 4️⃣ 5㗓DS PAGE Loading Buffer 称量1.25ml 1M Tris-HCl(pH6.8)、0.5g SDS、25mg溴酚蓝、2.5ml甘油，置于10ml塑料离心管中。加去离子水溶解后定容至5ml。小份（500/份）分装后，于室温保存。使用前加入25的2-ME。 5️⃣ 考马斯亮蓝R-250染色液称取1g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中。量取250ml异丙醇加入烧杯中，搅拌溶解。加入100ml冰醋酸，搅拌均匀。加入650ml去离子水，搅拌均匀。用滤纸除去颗粒物质后，室温保存。 6️⃣ 考马斯亮蓝染色脱色液量取100ml醋酸、50ml乙醇和850ml去离子水，充分混合后使用。 7️⃣ 凝胶固定液（SDS-PAGE银氨染色用）量取500ml甲醇、100ml醋酸和400ml去离子水，均匀混合后室温保存。 8️⃣ 凝胶处理液（SDS-PAGE银氨染色用）量取50ml甲醇、10ml戊二醛和40ml去离子水，均匀混合后室温保存。 9️⃣ 凝胶染色液（SDS-PAGE银氨染色用）量取2ml 20%AgNO₃、1ml浓NH₃ⷈ₂O和1ml 4%NaOH，加入96ml去离子水，均匀混合。如氨水浓度过低时溶液会呈混浊状，此时应补加浓氨水直至透明。现用现配，不宜保存。 𐟔Ÿ 显影液（SDS-PAGE银氨染色用）称量50mg柠檬酸和0.2ml甲醛，加入1L去离子水后摇动混合溶解。室温保存。

SDS-PAGE电泳原理与IEF技术详解 𐟌📄S-PAGE电泳原理 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种广泛用于分离大分子的技术，包括DNA、RNA和蛋白质。通过施加电场，带电离子在电泳过程中发生迁移。分子的迁移率取决于其净电荷和通过溶液的电阻。SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，其在较广的pH范围内带有净负电荷。多肽链与SDS结合，其结合量与其相对分子质量成比例，破坏蛋白质的复杂结构。在SDS-PAGE中，凝胶被分为浓缩胶和分离胶两层。浓缩胶位于底部，较大，而分离胶位于顶部，较窄。电泳缓冲液由甘氨酸制成，pH值为8.3。浓缩胶的pH值为6.8，而分离胶的pH值为8.8。电流由带负电荷的分子携带，向同一个方向迁移。在pH 8.3时，约有10%的甘氨酸分子带负电荷，因此电流主要由堆积缓冲液中的Cl-离子携带。Cl-离子在蛋白质之前朝堆积凝胶底部堆积，使得由SDS包裹的蛋白质分子被夹在甘氨酸分子和Cl-离子之间，被浓缩成比最初加载的体积小得多的条带。随着电流作用迁移，蛋白质迁移到分离胶中。此时，pH为8.8的分离凝胶缓冲液中的甘氨酸成为带负电荷的分子，能够非常快速的迁移，几乎与Cl-离子保持一致，而蛋白质紧随其后。蛋白质经由Cl-和甘氨酸阴离子的移动轨迹进入分离凝胶而携带电流。蛋白质变成一种具有类似流体动力学性质的杆状带负电荷高分子，其迁移率仅取决于其分子质量。 𐟌🧭‰电聚焦IEF分析等电聚焦（IEF）是一种基于蛋白质等电点（pI）分离蛋白质的电泳技术。当pI=pH时，蛋白质净电荷为0，因此蛋白质不会在电场中迁移。在IEF中，蛋白质的分离是在含有两性电解质混合物的聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中进行的，两性电解质在电场中迁移并在凝胶中形成pH梯度。蛋白分子被集中在一个具有pH梯度的介质中，通过介质的电流将产生带正电荷的氧化极和带负电荷的还原极。带电的蛋白质分子会向与其有相反电荷的一极运动，直到与周围pH值与其等电点相同时带电分子才停止在凝胶中运动，即蛋白质净电荷为0时。于是，具有相同等电点的蛋白质集中在pH固定的条带中。每种蛋白质都位于pH梯度中与其pI相对应的位置。

𐟌Š探索DNA琼脂糖凝胶电泳的奥秘𐟔 𐟑‹大家好！今天我们来聊聊DNA琼脂糖凝胶电泳技术，这可是生物实验中的一大法宝哦！ 𐟔젥ꌥŽŸ理首先，我们得搞清楚这个实验是怎么工作的。简单来说，DNA琼脂糖凝胶电泳是通过电场力将DNA片段分离的技术。就像是让不同大小的石头在水中漂流，大石头沉底，小石头浮在水面。 𐟧꠨獵𛆦�ꤊ接下来，我们来看看具体的操作步骤。首先，你需要准备好琼脂糖凝胶、DNA样品、电泳缓冲液等材料。然后，按照一定的比例将琼脂糖和缓冲液混合，倒入电泳槽中。接着，将DNA样品加入到凝胶中，通过电场力的作用，DNA片段会根据大小分离。最后，用特定的染料染色，观察结果。 𐟌᯸ 影响因素实验结果会受到多种因素的影响。比如，琼脂糖的浓度、电场的强度、染料的种类等都会影响实验效果。所以，做实验时一定要小心操作，确保每个步骤都准确无误。 ⚠️ 注意事项在做实验时，有几个关键点需要注意。首先，确保所有使用的溶液都是新鲜的，避免使用过期的试剂。其次，操作时要戴好手套和护目镜，防止化学物质溅到皮肤或眼睛里。最后，实验结束后要及时清理实验器材和实验室环境。 𐟔 常见问题分析在实验过程中，可能会遇到一些常见问题。比如，电泳条带不清晰、DNA片段分离不完全等。遇到这些问题时，不要慌张，先检查操作步骤是否正确，然后查找原因并解决。 𐟓š 总结通过这次分享，希望大家对DNA琼脂糖凝胶电泳技术有了更深入的了解。实验技术是一门需要不断学习和实践的技能，希望大家都能在实验中找到乐趣并取得成功！

DNA大小相同但电泳条带位置不同的原因 𐟌 在进行 DNA 电泳实验时，有时会发现 DNA 分子大小相同，但电泳条带位置却有所不同。这可能是由于以下原因： 1️⃣ 分子构象差异：即使 DNA 分子大小相同，它们的空间构象可能不同。例如，超螺旋的 DNA 分子比线性或环形 DNA 分子更加紧密，因此在电场中受到的阻力较小，迁移速度更快，导致在凝胶中的位置更靠前。 2️⃣ DNA 修饰：DNA 分子可能发生甲基化、磷酸化等修饰，这些修饰会改变 DNA 分子的电荷性质和空间结构，从而影响其在电场中的泳动速率。 3️⃣ 结合的其他分子：DNA 分子可能与其他蛋白质、金属离子或小分子化合物结合，这些结合物会增加 DNA 分子的质量和体积，改变其电荷分布，进而影响电泳迁移。 4️⃣ 凝胶的均匀度：如果制备的凝胶不均匀，存在局部孔径大小不一致的情况，相同大小的 DNA 分子在不同孔径区域的迁移速度会有差别，导致条带位置不同。 5️⃣ 电泳缓冲液：缓冲液的离子强度、pH 值等参数如果不一致，会影响 DNA 分子的解离状态和所带电荷，进而影响其在电场中的泳动速度。 𐟔 为了判断 DNA 大小相同但电泳条带位置不同的原因，可以通过以下几种方法：核酸构象分析：酶处理：使用能够特异性作用于不同构象 DNA 的酶进行处理，如拓扑异构酶。如果处理后电泳条带位置发生变化，可初步判断与构象有关。热变性实验：将样品进行加热处理，使 DNA 分子的二级结构打开，观察电泳条带的变化。如果加热后条带位置趋于一致，可能说明原始差异是由构象导致。检测 DNA 修饰：甲基化检测：使用甲基化特异性的抗体或化学检测方法，检测 DNA 是否存在甲基化修饰。其他修饰检测：针对可能的磷酸化等修饰，使用相应的检测试剂和方法进行检测。检测结合分子：蛋白酶处理：如果怀疑有蛋白质结合，使用蛋白酶处理样品后进行电泳，观察条带变化。金属离子螯合剂：加入金属离子螯合剂，去除可能结合的金属离子，观察电泳结果。凝胶检查：重复凝胶制备：重新制备凝胶，确保凝胶的浓度均匀、孔径一致，进行电泳对比实验，如果条带位置变化，说明原凝胶存在问题。缓冲液检查：更换缓冲液：使用标准缓冲液进行电泳，与原缓冲液的电泳结果对比，如果条带位置改变，说明缓冲液的离子强度或 pH 值等因素是影响因素之一。通过以上方法，可以更准确地确定 DNA 大小相同但电泳条带位置不同的原因。

Wb实验时间缩短的4个实用技巧 Wb实验操作复杂，耗时较长。以下4个实用技巧可以帮助你缩短实验时间，提高效率。 𐟧ꠧŒ–凝胶制备步骤传统方法制备凝胶需要较长时间，但通过优化步骤，可以将整个过程缩短到10分钟。TEMED催化AP生成自由基，引发双丙烯酰胺和丙烯酰胺之间的交联，形成一个三维网络。前五种试剂可以混合到一个系统中，并在4℃的黑暗中保存一个月或更长时间。这样，整个复合步骤就被简化为预制胶系统和AP。 𐟔„ 优化电泳缓冲液传统的电泳液随着电压的升高会丢失部分蛋白质。为了加快电泳速度，可以对运行缓冲液的配方进行修改。改进后的运行缓冲液，室温下200V可以在35分钟内完成电泳。令人惊讶的是，当电压设置为300V时，它仍然正常工作。 ⚖️ 调整电转移时间不同分子量的蛋白质具有不同最合适的电转移时间。根据实验经验，建议设置以下参数：10-25kDa、250V、15分钟；25-55kDa、250V、20分钟；55-70kDa、250V、25分钟；以及70-130kDa、250V、30-35分钟。 𐟓栩€‰择合适的膜 0.22⵭的PVDF膜比0.45⵭的NC膜对小分子量蛋白的拦截能力更强。选择合适的膜可以提高实验的准确性和效率。通过以上方法，你可以有效缩短Wb实验时间，提高工作效率。

琼脂糖凝胶电泳全攻略：从缓冲液到保存琼脂糖凝胶电泳是分离和检测DNA片段的重要方法。以下是详细的制备步骤和注意事项，帮助你成功进行实验。 𐟔 配制缓冲液首先，配制适量的电泳缓冲液，通常是0.5㗔BE或1㗔AE。 𐟓– 加入琼脂糖粉根据所需的制胶量和凝胶浓度，在三角锥瓶或平底烧瓶中加入准确称量的琼脂糖粉。注意，总液体量不应超过容器容量的50%。 𐟔堦𚶨ƒ𖊥𐆤𘉨璩”姓𖦈–平底烧瓶放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。加热过程中，当溶液沸腾时，戴上防热手套，小心摇动容器，确保琼脂糖充分溶解。重复此步骤，直到琼脂糖完全溶解。注意，加热时间不宜过长，以免过热暴沸，影响凝胶浓度。 𐟒ᠥŠ 入溴化乙锭当溶液冷却至约60℃时，加入终浓度为0.5 /ml的溴化乙锭溶液，并充分混匀。注意，溴化乙锭是一种致癌物质，使用时请戴手套。 𐟏„‍♂️ 倒胶将溶解好的琼脂糖溶液倒入制胶模中，并在适当位置插入梳子。凝胶厚度一般控制在3-5 mm之间。 𐟧Š 凝胶凝固在室温下让凝胶自然凝固，大约需要30分钟到1小时。凝固后的凝胶可用于电泳实验。如果暂时不使用，可以用保鲜膜包好后在4℃下保存，一般可保存2-5天。 𐟧젧𜨄‚糖的选择琼脂糖的质量直接影响DNA的分辨能力和电泳结果的清晰度。使用高质量的琼脂糖对实验的成功至关重要。通过以上步骤，你可以成功制备琼脂糖凝胶，并进行DNA片段的分离和检测。记得在实验过程中遵守安全规范，确保实验顺利进行。

影响核酸凝胶电泳结果的五大因素探索核酸凝胶电泳的奥秘，我们发现有许多因素影响着实验的结果。让我们一起来看看这些关键因素吧！𐟔 1️⃣ DNA样品的纯度和状态 𐟒犄NA样品的纯度是电泳结果清晰的关键。如果样品中含有过多的盐或杂质蛋白，可能会导致条带模糊甚至缺失。乙醇沉淀可以去除多余的盐，而酚则可以去除蛋白。记住，变性的DNA样品可能会导致条带模糊和缺失，因此在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 2️⃣ DNA的上样 𐟓 正确的DNA上样量是保证条带清晰的关键。上样量过大可能导致DNA带型模糊，影响判断其大小；而上样量太小则会导致带信号弱甚至缺失。 3️⃣ Marker的选择 𐟎œ脎A电泳中，使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小是非常重要的。选择在目标片段大小附近ladder较密的Marker，可以更准确地估计目标片段大小。如果选择NA/HindIII或者NA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5分钟，冰上冷却后使用，以避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。 4️⃣ 凝胶的染色和观察 𐟌ˆ 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭(EB)，染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。观察凝胶时，应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。 5️⃣ 凝胶图的分析 𐟓Š 通过分析凝胶图，我们可以检测到DNA的降解或其他杂质的存在。例如，线性的单一DNA样品一般是单条带，质粒的话可能会有2-3条带，这和DNA分子的构象有关。如果条带变宽、变暗、或者变成弥散的DNA条带，表示DNA非特异的降解，还有一种可能是太久没有更换电泳缓冲液造成的。如果有蛋白质污染，上样孔可能发亮。如果跑胶时DNA上样量过多导致条带宽度大，无法准确判断其大小。通过这些关键因素的分析，我们可以更好地理解和控制核酸凝胶电泳的结果，从而获得更准确和可靠的数据。𐟓ˆ

𐟌᯸ 低温恒温槽的多样化应用场景 𐟌Ÿ 低温恒温槽在许多领域都有着广泛的应用，以下是其中的一些例子： 𐟔젧‰馀禵‹试：用于测量材料在不同温度下的物理性质，如粘度和密度，为材料研究提供重要数据。 𐟧ꠥŒ–学分析：控制化学反应体系的温度，确保实验条件的一致性，提高实验结果的准确性和可重复性。 𐟧젧”Ÿ物制药：提供恒定的低温环境，保持生物样本的活性，对生物制药研究至关重要。 𐟒‰ 医用冷帽：用于头部冷却，减少患者因高温引起的不适，提高患者的舒适度和治疗效果。 𐟧Š 降温毯：在急救或手术中使用，帮助调节患者体温，提高手术成功率和患者的生存率。 𐟓 计量质检：提供精确的温度标准，确保测量结果的准确性和可靠性。 𐟏렩똧퉩™⦠᧠”究：为科学实验提供精确控制的恒温环境，推动科学研究的发展和进步。 𐟏�𗥥Ž‚实验室：模拟特定温度环境下的产品性能，提高产品的质量和竞争力。 𐟌᯸ 电泳仪：保持电泳缓冲液的恒定温度，确保实验结果的准确性和可靠性。 𐟒栦—‹转蒸发器：与旋转蒸发器配合使用，提供恒定的低温条件，用于溶剂回收和样品浓缩，提高实验效率。

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